Techniques de microscopie

Voici un petit guide sur les principales techniques de microscopie pour amateurs et professionnels.

Qu’est-ce que la microscopie en champ clair ?

La microscopie à fond clair est la technique classique. Elle convient à l’observation des couleurs naturelles d’un spécimen ou à l’observation d’échantillons colorés. Le spécimen apparaît plus sombre sur un fond clair. Afin d’augmenter le contraste, il faut fermer le condenseur. Cela réduira la résolution, mais il faut trouver un compromis. La diffraction augmente et les bords du spécimen deviennent plus sombres (même s’ils ne le sont pas en réalité). Il s’agit d’artefacts, mais ils rendent plus visibles les spécimens difficiles à voir (par exemple, les bactéries).

Convient à la microscopie amateure. C’est la technique standard dont tous les microscopes sont capables.

Qu’est-ce que la microscopie en champ noir (Darkfield) ?

En microscopie standard (à fond clair), une lumière vive brille derrière l’échantillon et l’échantillon apparaît sous la forme d’une image sombre devant lui. Les spécimens petits ou transparents ont tout simplement trop peu de contraste pour que nos yeux puissent les voir. Une solution consiste à teindre ou tacher l’échantillon. Mais ce serait bien d’avoir des techniques qui ne tuent pas le spécimen ou ne nécessitent pas de coloration. L’une de ces techniques est la microscopie à fond noir. En fond noir, nous bloquons la lumière qui va directement dans l’objectif, de sorte que le fond semble noir.

Daphnia au microscope en darkfield - champ noir - Techniques de microscopie

Cependant, nous permettons à la partie de la lumière qui brille sur le côté de frapper l’échantillon et de rebondir dans l’objectif. Le résultat est un spécimen brillant sur un fond sombre. Bien que cela ne semble pas très impressionnant lorsqu’on le décrit, cela fait une différence très importante en pratique. Une goutte d’eau qui est apparemment vide en fond clair sera souvent grouillante de bactéries, de levures et d’eucaryotes lorsqu’elle est vue en fond noir.

Pour faire du fond noir, la lumière doit provenir des côtés, à l’extérieur du cône qui est directement visible pour l’objectif. Les condenseurs à fond noir sont conçus pour faire briller la lumière sur les côtés

À mesure que les grossissements augmentent, les ouvertures numériques des objectifs augmentent également (la largeur du cône de lumière que l’objectif peut voir). Le condenseur à fond noir fonctionnera bien jusqu’à 40X, et un condenseur à fond noir à huile peut, s’il est correctement centré, peut fonctionner à 100X.

Une technique apparentée est l’Illumination de Rheinberg.

Qu’est-ce que l’illumination de Rheinberg ?

Microscope-eclairage-Rheinberg - Techniques de microscopie

Une technique apparentée est l’illumination Rheinberg, dans laquelle on utilise un filtre d’une couleur dans la région centrale et une couleur différente à l’extérieur. L’image résultante parait être bleu foncé en arrière-plan alors que les spécimens sont éclairés par une lumière rouge vif.

Qu’est-ce que la microscopie à contraste de phase ?

Une des techniques de microscopie avancée pour augmenter le contraste dans une image est le contraste de phase. Dans un tel système, le condenseur ne laisse passer qu’un faisceau de lumière à travers l’échantillon. L’objectif possède un anneau correspondant avec un matériau qui retarde la lumière de ½ de sa longueur d’onde. Il en résulte un effet d’annulation des ondes qui dépend des propriétés optiques de l’échantillon. Sous contraste de phase, l’arrière-plan devient quelque peu sombre et les éléments transparents s’illuminent brillamment. De nombreuses choses qui sont complètement transparentes à la lumière ordinaire seront clairement visibles. Cette technique facilite les découvertes en biologie et est utile pour de nombreux spécimens qui ne fonctionnent pas bien en fond clair.

Exemple d'observation  pollen d'aulne gris x1000 en contraste de phase - Techniques de microscopie

Afin d’avoir un contraste de phase fonctionnel, vous devez utiliser un condenseur de contraste de phase correspondant à votre grossissement et vous avez besoin d’un objectif de contraste de phase. Normalement, les condenseurs à contraste de phase peuvent également être utilisés avec des objectifs ordinaires. Le contraste de phase n’est pas toujours meilleur que la microscopie ordinaire. Il y a certains artefacts, tels que des halos autour de petits objets qui ne sont pas toujours esthétiques. 

Vous pouvez également utiliser un objectif à contraste de phase avec un condensateur pour fond clair, avec une perte de contraste modérée.

Comparé au prix d’un microscope d’entrée de gamme, un kit de contraste de phase avec objectifs et condensateur est souvent assez cher. D’après mon expérience, cela vaut la peine d’avoir un microscope séparé dédié à la microscopie à contraste de phase. Plutôt que de mettre des objectifs à contraste de phase et un condenseur dans votre microscope principal.

L’article wikipedia est très bien je trouve.


Que signifie ‘contraste interférentiel’ (DIC – Differential interference contrast en anglais) ?

Illustration Micro organisme en DIC au microscope

Une des techniques de microscopie d’amélioration du contraste encore plus avancée est la DIC. La DIC utilise également des motifs d’interférence pour rendre visibles les objets transparents. Les différences de densité optique se transforment en zones claires et sombres. Le résultat est une image du spécimen qui ressemble à un objet 3D avec un éclairage d’un côté. Les images DIC sont parmi les plus esthétiques et, comme le contraste de phase, permettent à l’utilisateur de voir de nombreuses choses non visibles avec une microscopie à fond clair ordinaire. 

Les différences de densité, comme dans les organismes cellulaires, deviennent facilement visibles. En raison de la nature de la technique, l’arrière-plan d’une image DIC est généralement bleu ou jaune/orange. La technique de microscopie DIC nécessite un polariseur, un prisme DIC inférieur sous le condenseur, un autre prisme et un film polarisant entre l’objectif et l’oculaire. Ces prismes DIC fonctionnent pour un ou deux objectifs et sont assez chers. Prévoyez de dépenser au moins plusieurs milliers d’euros pour un kit DIC. Il ne sera disponible que pour les microscopes haut de gamme. L’un des avantages du DIC par rapport au contraste de phase est qu’il fonctionne avec des objectifs à fond clair ordinaires. Les prismes DIC sont généralement configurés pour fonctionner avec un objectif à fond clair particulier, généralement en fluorite ou apochromatique.

Qu’est-ce que l’illumination oblique ?

Astuce : Il existe une possibilité très facile (et bon marché !) d’imiter la DIC. La résolution n’est pas aussi élevée, mais les résultats peuvent aussi être très beaux. L’illumination oblique peut-être réalisée de deux manières : Vous pouvez insérer un filtre à fond noir dans le porte-filtre, puis faire pivoter partiellement le filtre. Vous pouvez également fabriquer des filtres d’éclairage oblique en carton, qui bloquent la lumière d’un côté. Dans les deux cas, la lumière frappe l’objet par le côté, ce qui permet de mieux faire ressortir certaines structures, comme si elles projetaient des ombres.

Convient à la microscopie amateure : Cette technique est fortement recommandée en raison de sa facilité d’utilisation, de son faible coût et de son fort effet visuel.

Qu’est-ce que la microscopie en polarisation ?

La polarisation est une des techniques les plus puissante en microscopie. Si vous placez un filtre polarisé entre la source lumineuse et l’échantillon (le « polariseur ») et en placez un autre entre l’objectif et l’oculaire (l’« analyseur »), alors vous pouvez faire une microscopie à lumière polarisée. Faites pivoter le filtre inférieur jusqu’à ce qu’il soit à 90 degrés du filtre supérieur afin que l’arrière-plan devienne sombre (extinction). Tout élément de l’échantillon qui déforme la lumière de sorte qu’il n’a plus la même orientation après avoir traversé le premier filtre s’illuminera sur le fond sombre.

Microscopie-roche-lumière-polarisée - Techniques de microscopie

Les organismes à corps mou et de nombreux échantillons biologiques ne changeront pas suffisamment la direction de la lumière pour faire une grande différence, bien que vous puissiez parfois voir la nourriture qu’ils ont mangée et certaines structures en eux. En revanche, les objets durs sont parfois brillants, avec un arc-en-ciel de couleurs. Les poils, les cristaux, etc., peuvent être très impressionnants.

La polarisation vous montre des choses différentes des autres méthodes de microscopie. Ce n’est pas toujours plus intéressant, mais tout ce qui est différent offre la possibilité d’apprendre quelque chose de nouveau.

Certains microscopes polarisants ont la capacité de faire pivoter l’échantillon et de mesurer de combien de degrés il a été tourné. Cette technique s’utilise pour certaines opérations quantitatives, telles que l’identification des cristaux. 

Pour le travail de loisir, la plupart du temps, les platines rotatives ne sont pas nécessaires. Il est agréable d’avoir un curseur d’analyse ou une tourelle entre l’objectif et l’oculaire afin de pouvoir passer de la microscopie polarisée à d’autres formes de microscopie. Si vous n’en disposez pas, vous pouvez parfois placer un morceau de film à l’intérieur du microscope, dans l’espace situé sous la tête. La pellicule inférieure est très facile – en général, vous pouvez la placer au-dessus de la lentille d’illumination ou dans la fente du filtre du condenseur.

Amscope T490 avec filtre polarisant artisanal
Amscope T490 avec filtre polarisant artisanal

Qu’est-ce que la microscopie à Fluorescence ?

Exemple d'image de microscopie à fluorescence - Techniques de microscopie

La fluorescence est un phénomène dans lequel la lumière émise avec une gamme étroite de longueurs d’onde est absorbée et ré-émise par des molécules fluorescentes, appelées fluorophores, contenues dans l’échantillon. Pour cela, la microscopie à fluorescence est réalisée en combinaison avec un microscope optique de base en ajoutant une source de lumière puissante, des filtres spéciaux et des substances chimiques spéciales pour étiqueter l’échantillon par fluorescence.

La phosphorescence désigne la photoluminescence liée à la fluorescence.
Lorsque certaines molécules absorbent de l’énergie radiante, elles deviennent excitées et libèrent ensuite une grande partie de leur énergie piégée sous forme de lumière. Cette lumière s’appelle « lumière de fluorescence », elle est émise très rapidement par la molécule excitée.

La lumière traverse un filtre excitateur et ne transmet que la longueur d’onde souhaitée. Un condenseur à fond noir fournit un fond sur lequel les objets fluorescents brillent. En général, l’échantillon a été coloré avec des colorants, appelés fluorochromes. Les microscopes à fluorescence ne sont pas réservés aux laboratoires de recherche. Il est tout a fait possible de s’équiper pour environ 1500€ et prendre le temps de se former aux différentes techniques de préparation de l’échantillon.

Objectif de microscope à fluorescence - Techniques de microscopie

Qu’est-ce que l’Eclairage de Köhler ?

Eclairage de Köhler - exemple d'observation - Siphonophore planctonique - Techniques de microscopie

Il réduit la lumière parasite en n’éclairant que la partie du spécimen qu’on observe. Plus le grossissement de l’objectif est grand, plus la zone visible se réduit. L’éclairage de Köhler limite la lumière à la partie du spécimen qui se trouve actuellement dans le champ de vision. Cela augmente le contraste de l’image. Car les autres parties du spécimen ne sont pas en mesure de réfléchir la lumière par le côté dans l’objectif. L’éclairage de Köhler garantit également que l’ensemble de l’échantillon s’éclaire de manière uniforme.

Les microscopes de Köhler possèdent un système optique et un diaphragme supplémentaires montés juste au-dessus de la lampe. En ajustant le diaphragme, il est possible de limiter la lumière aux parties pertinentes de l’échantillon.

Traitement d’images en microscopie

Une des techniques de microscopie que je dois mentionner ici est le traitement d’image post observation sur ordinateur. Il est possible d’extraire de l’information et d’améliorer considérablement la qualité des images avec des programmes de traitement d’images, sans pour autant utiliser un meilleur système optique. Par exemple la super résolution, la segmentation d’image, la réduction du flou ou l’augmentation du contraste se classent dans les techniques de microscopie post traitement.

Exemple de logiciel TI-microscope
Exemple de logiciel TI-microscope

Conclusion

J’espère que ce résumé des techniques de microscopies vous servira dans votre choix de microscope. Je n’ai pas évoqué les techniques de microscopie qu’on utilise en microscopie électronique, ou encore la technique de microscopie confocal car elles ne s’adressent pas en général à un publique amateur. Mais se pratiquent dans les laboratoires de recherche. Cependant c’est avec ces techniques que l’on obtient les images les plus impressionnantes. Pour en savoir plus, reportez-vous aux différents articles en ligne sur le site.

Pour en savoir plus rendez-vous sur la page des articles sur les techniques et les observations au microscope.

Voir aussi : Lexique de microscopieTuto de microscopie ainsi que la page sur les objectifs

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